指利用高通量测序技术进行cDNA测序,全面快速地获取某一种特定器官或组织在某一状态下的几乎所有转录本。目前转录组测序产品有真核有参转录组测序、真核无参转录组测序和原核转录组测序。
福尔马林固定石蜡包埋。
送样要求:新鲜FFPE组织切片,厚度不超过10um(过厚会导致RNA得率低),每次用量大约8片,表面积不超过250mm2。
常温运输保存。
图1 样品相关性检验 图2 基因差异表达火山图 图3 不同组间的差异图4 基因有向无环图
简述真核转录组常规建库流程
1)通过磁珠和mRNA的polyA结构将mRNA分离出来;
2)mRNA片段化;
3)mRNA反转录为双链结构,第二链cDNA合成时,其中的碱基T,被替换成U,从而达到链特异性文库的目的;
4)5’末端修复、3’末端加A;
5)加接头;
6)选择特异长度回收,一般为300bp;
7)PCR;
8)上机测序。
如何对得到的数目较多的差异基因进行后期验证?
首先根据GO或者KEGG富集结果,或者客户关注的基因,选取有代表性的进行qRT-RCR验证。然后根据RPKM值,选择RPKM值差异倍数答,同时p值小的基因进行qRT-RCR验证。